靶序列模拟技术在抗CMV中的作用研究

【摘要】黄瓜花叶病毒（CMV）是危害最为严重的植物病原之一，越来越多地被作为模式病毒用于植物与病毒的互作研究。由于抗性基因的缺乏，使得该病毒的防治工作收效甚微。至今，抗CMV病毒研究工作主要集中在转基因表达病毒来源的蛋白或基因部分序列，或者表达CMV的卫星RNA。因此，寻找更为有效地抗病毒的方法和策略是防治植物病毒病的主要任务之一。本论文利用最近报道的靶序列模拟技术(TargetMimicry,TM)，以CMV作为研究对象，探索该技术在抗植物病毒中的可行性。模拟靶序列是一种能被miRNA识别并互作的目标序列，但不被miRNA切割。通过设计miRNA的模拟靶序列，并将其整合入病毒基因组，利用植物编码的miRNA与模拟靶序列的结合，分析二者的结合对CMV的复制、翻译和积累水平以及致病性的影响，明确靶序列模拟技术在CMV防治研究中的可行性。首先，我们将miR159、miR162和miR170的模拟靶序列承载于含有报告基因GFP的CMV-GFPRNA3上，通过浸润接种侵染本氏烟。荧光观察结果与Western印迹结果显示：实验组的报告基因GFP荧光表达量均显著弱于对照组。可见，内源miRNA与其模拟靶序列结合抑制了病毒的积累。进而，我们从病毒的负链合成及翻译水平两个方面分析靶序列模拟技术抑制病毒积累的作用层面。我们将miR162、miR164和miR170的模拟靶序列承载于非完整的CMV-GFPRNA3上，荧光观察结果显示：实验组的荧光量均明显弱于对照组，说明内源miRNA与其模拟靶序列结合显著抑制了蛋白的翻译。我们提取样品叶组织总RNA，反转录出GFP的负链cDNA，经PCR后的结果显示：实验组的GFP负链含量均有不同程度的低于对照组，这说明miRNA与其模拟靶序列结合在一定程度上抑制了CMV负链的形成。最后，我们将模拟靶序列插入野生型CMV的各个基因组RNA上，通过Northern杂交检测病毒各个基因组的积累量，结果显示：模拟靶序列对完整病毒的积累具有不同程度的抑制作用。综上所述，通过本论文的实验研究，我们初步确定靶序列模拟承载于CMV之上，通过减弱病毒基因组负链的合成和病毒蛋白的翻译，在一定程度上抑制病毒的积累。将此技术延伸于转基因植物，有望建立一套抗病毒的新方法。
【作者】陈文虎；
【导师】杜志游；
【作者基本信息】浙江理工大学，生物化学与分子生物学，2014，硕士
【关键词】黄瓜花叶病毒；靶序列模拟技术；miRNA；拟南芥；

【参考文献】
[1]唐发明,王仲东,陈绵云.支持向量机多类分类算法研究[J].控制与决策,2005,07:746-749+754.
[2]杨欣瑜.铜川中心城市城乡居民点统筹布局模式及规划策略研究[D].西安建筑科技大学,建筑与土木工程,2013,硕士.
[3]涂家云.人力资本积累与社会经济发展相关性分析[D].武汉理工大学,技术经济及管理,2003,硕士.
[4]周天亮.论影像在当代油画中的应用[D].渤海大学,美术学,2014,硕士.
[5]赵普,瞿静文,马建华.江苏电网调度运行与生产管理系统的集成方案[J].电力系统自动化,2010,06:104-106.
[6]陈蒙蒙.雨量水位监测系统设计[D].杭州电子科技大学,控制工程,2013,硕士.
[7]张媛媛,祁晓炜,李光九,孙伟,焦奎.石墨烯和纳米金修饰电极检测李斯特氏菌特征DNA序列[A].中国化学会.中国化学会第28届学术年会第9分会场摘要集[C].中国化学会:,2012:1.
[8]杨骐宁,姜丹生,曹扬,汪志明,蔡鹏飞,周勇伟.小切口双纽扣钛板系统治疗肩锁关节脱位[J].浙江创伤外科,2014,02:274-275.
[9]于璐.应用位点特异性自旋标记电子顺磁共振技术探究蛋白质结构特征[D].中国科学技术大学,生物化学与分子生物学,2014,博士.
[10]窦金启.戏曲动画及其艺术性和传播理念研究[D].山西师范大学,戏剧戏曲学,2013,硕士.
[11]韦岗,张丽清,李向武,欧阳景正.语音信号同伦非线性模型分析理论与算法[J].自动化学报,1997,02:59-64.
[12]卜香娟.Banach空间中一类压缩型映射的不动点定理[D].西北大学,基础数学,2013,硕士.
[13]赵东强.基于地域文化的佛堂镇风貌特色规划设计研究[D].浙江大学,2013.
[14]黄德民.我国高校官方微博的现状和发展策略研究[D].中南民族大学,传播学,2013,硕士.
[15]姜冠群.二维动画和三维动画在视觉传达中演变过程的研究[D].哈尔滨理工大学,设计艺术学,2012,硕士.
[16]冯慧子.老年人犯罪的刑罚问题研究[D].郑州大学,刑法,2013,硕士.
[17]虞琛.论《紫颜色》的叙事形式与特征[D].湖南师范大学,英语语言文学,2012,硕士.
[18]李静.一体式中空纤维帘式膜生物反应器性能的研究[D].天津工业大学,材料学,2004,硕士.
[19]刘燕霞.新会区乡镇村干部社会保障现状及对策研究[D].华南理工大学,公共管理（专业学位）,2012,硕士.
[20]张洪岩,励惠国.数字地球时代的地理信息科学[A].东北三省测绘学会、测绘科技信息网.2001年东北三省测绘学术与信息交流会论文集[C].东北三省测绘学会、测绘科技信息网:,2001:4.
[21]王磊.基于Web的电力设备在线监测与故障诊断系统设计[D].北京交通大学,电气工程,2012,硕士.
[22]邵金鹏.美国产权保险法律制度及其对我国的启示[D].华中科技大学,法律,2013,硕士.
[23]陈希昌.农超对接模式下农产品冷链物流成本优化[D].长安大学,交通运输工程（专业学位）,2014,硕士.
[24]张锐.荔枝果皮在着色发育过程中的钾、钙与镁含量变化及其对着色的影响[D].海南大学,果树学,2014,硕士.
[25]王雪松.蒿属三种植物精油及甲酸乙酯对两种储粮害虫和熏蒸活性研究[D].东北师范大学,动物学,2012,硕士.
[26]刘洁.乌司他丁对大鼠急性坏死性胰腺炎的保护作用及相关机制的实验研究[D].苏州大学,内科学,2014,硕士.
[27]许高洁.锂二次电池电极材料的研究[D].中国海洋大学,2012.
[28]王文强.美国经济发展面临的困境及其对中美经贸关系的影响[D].东北师范大学,世界经济,2012,硕士.
[29]南佩凤.环形交叉口通行能力与信号控制方法研究[D].吉林大学,交通信息工程及控制,2014,硕士.
[30]张国超.微小型无人直升机导航系统传感器故障诊断研究[D].浙江大学,导航制导与控制,2012,硕士.
[31]陈玉涛,杨建源.核电产品的市场开发及其前景[J].一重技术.1997(02)
[32]刘秀娥.浅谈如何提高中职德育课的吸引力[J].中国校外教育.
[33]刘鹏.基于FPGA的PCM并行控制器设计[D].山东大学,软件工程（专业学位）,2013,硕士.
[34]郭建.裂隙介质中的各向异性研究[J].石油地球物理勘探,1993,03:348-353+378.
[35]周威成.信息过滤方法的研究与应用[D].华北电力大学（北京）,2003.
[36]王菁.中小学教师参与校本课程评价的研究[D].湖北大学,课程与教学论,2012,硕士.
[37]滕谦谦.STW研究历程及其对我国的启示[D].华东师范大学,职业技术教育学,2013,硕士.
[38]杨帆.自然条件下吗啡对大头金蝇幼虫的影响[D].河北医科大学,病原生物学,2014,硕士.
[39]曲梦.新疆阿尔泰可可托海海蓝宝石的宝石矿物学研究[D].中国地质大学（北京）,宝石学,2014,硕士.
[40]吕勇,杨坚,梁兆新,莫建霖,乔艳辉.单圆盘甘蔗切割器影响破头率的运动学仿真[J].农业机械学报.2008(04)
[41]陈玲玲.初中起点“2+4”小学教育专业基础数学有效教学的探究与实践[D].鲁东大学,学科教学（专业学位）,2013,硕士.
[42]娜日苏.酵母菌的筛选及其发酵能源草产乙醇特性的初步研究[D].内蒙古师范大学,植物学,2013,硕士.
[43]万新宇.思想政治课学习策略探究[D].东北师范大学,教育,2003,硕士.
[44]齐卫.舟山群岛新区“新海洋文化”发展初探[D].浙江海洋学院,农业推广（专业学位）,2013,硕士.
[45]孙健.晚明主情思潮的嬗变[D].西安音乐学院,音乐美学,2014,硕士.
[46]张小明.我国人格权商品化保护的法律研究[D].河北大学,法律,2014,硕士.
[47]李倩.板蓝根多糖免疫佐剂功能及机理研究[D].吉林大学,药理学,2013,硕士.
[48]刘玉莹.表面电荷对纳微球佐剂效果的影响之细胞水平研究[D].北京化工大学,微生物与生化药学,2013,硕士.
[49]傅杰.设计合成高活性层状钛酸盐基可见光催化剂[D].浙江理工大学,应用化学,2013,硕士.
[50]魏玉洪.王府井百货集团发展战略演变案例分析[D].河北工业大学,工商管理,2013,硕士.